在完成HDF-a細(xì)胞的傳代操作后，需特別注意培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定性。建議將培養(yǎng)箱的CO?濃度嚴(yán)格控制在5%，溫度維持在37℃，并每日記錄培養(yǎng)箱參數(shù)。若使用水套式培養(yǎng)箱，應(yīng)確保水位處于標(biāo)準(zhǔn)線以上，避免溫度波動(dòng)對(duì)細(xì)胞狀態(tài)造成影響。

細(xì)胞凍存環(huán)節(jié)需格外謹(jǐn)慎。配制凍存液時(shí)，建議使用新鮮配置的90%胎牛血清+10%DMSO組合，并在冰上預(yù)冷30分鐘。凍存細(xì)胞密度應(yīng)控制在1×10?/ml左右，采用梯度降溫法：先置于4℃30分鐘，再轉(zhuǎn)移至-20℃2小時(shí)，最后放入-80℃過夜，24小時(shí)內(nèi)轉(zhuǎn)入液氮長(zhǎng)期保存。值得注意的是，DMSO對(duì)細(xì)胞具有毒性，解凍后需立即離心去除凍存液。

對(duì)于細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，推薦使用脂質(zhì)體法時(shí)保持細(xì)胞融合度在70-80%。轉(zhuǎn)染前2小時(shí)更換為無抗生素培養(yǎng)基，DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物形成時(shí)間控制在20-25分鐘為宜。轉(zhuǎn)染后6小時(shí)需更換新鮮完全培養(yǎng)基，避免脂質(zhì)體長(zhǎng)時(shí)間作用產(chǎn)生細(xì)胞毒性。

在免疫熒光檢測(cè)時(shí)，固定細(xì)胞建議使用4%多聚甲醛（PFA）室溫固定15分鐘，而非甲醇固定，以更好保持細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)。封閉液建議使用含5%BSA的PBS溶液，封閉時(shí)間不少于1小時(shí)。一抗孵育后，需用PBST（0.1%Tween-20）充分洗滌3次，每次5分鐘，避免非特異性結(jié)合。

特別提醒：所有涉及HDF-a的實(shí)驗(yàn)操作均需在生物安全柜中進(jìn)行，操作前開啟紫外滅菌30分鐘，工作時(shí)保持適當(dāng)氣流（通常為0.3-0.5m/s）。定期用75%乙醇擦拭臺(tái)面，不同細(xì)胞系間操作需更換手套并灼燒鑷子，嚴(yán)防交叉污染。實(shí)驗(yàn)廢棄物應(yīng)分類處理，接觸過細(xì)胞的耗材需經(jīng)10%次氯酸鈉溶液浸泡消毒后再丟棄。
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