克隆化一般是指將抗體陽性孔進行克隆化。犚r為經(jīng)過HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個孔內(nèi)只有一個克隆。在實際工作中，可能會有數(shù)個甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細胞、抗體非分泌細胞；所需要的抗體特異性抗體分泌細胞和其它無關抗體分泌細胞。要想將這些細胞彼此分開，就需要克隆化?？寺』脑瓌t是，對于檢測抗體陽性的雜交克隆應盡早進行克隆化，否則抗體分泌的細胞會被抗體非分泌的細胞所抑制，因為抗體非分泌細胞的生長速度比抗體分泌的細胞生長速度快，二者競爭的結(jié)果會使抗體分泌的細胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細胞的突變或染色體丟失，從而喪失產(chǎn)生抗體的能力。
一 克隆化方案
用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀釋和軟瓊脂平板法。
1. 有限稀釋法的程序
① 制備飼養(yǎng)細胞懸液同融合前準備
?、凇￡栃钥准毎挠嫈?shù)，并調(diào)細胞數(shù)在1～5×10３／ml
?、邸∪?30個細胞放入6.5ml含飼養(yǎng)細胞完全培養(yǎng)液，即20個細胞／ml，100μl／孔加A、B、C三排為每孔2個細胞。余下2.9ml細胞懸液補加2.9ml含飼養(yǎng)細胞的完全培養(yǎng)液,細胞數(shù)為10個／ml，100μl／孔加D、E、F三排，為每孔1個細胞。余下2.2ml細胞懸液補加2.2ml含飼養(yǎng)細胞的完全培養(yǎng)液，細胞數(shù)5個／ml，100μl／孔，加G、H兩排，為每孔0.5個細胞。
④ 培養(yǎng)4～5天后，在倒置顯微鏡上可見到小的細胞克隆，補加完全培養(yǎng)液200μl／孔。
?、荨〉?～9天時，肉眼可見細胞克隆，及時進行抗體檢測。
注:初次克隆化的雜交瘤細胞需要在完全培養(yǎng)液中加HT。
2. 軟瓊脂法
?、佟≤洯傊呐渲?/p>
含20％FCS小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640
1％瓊脂水溶液：高壓滅菌，42℃預熱。
0.5％瓊脂：由1份1％瓊脂加1份含20％小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配制而成。置42℃保溫。
② 用上述0.5％瓊脂液含有飼養(yǎng)細胞15ml傾注于直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固后作為基底層備用。
③ 按100／ml，500／ml或5000／ml等濃度配制需克隆的細胞懸液。
?、堋?ml 0.5％瓊脂液42℃預熱在室溫中分別與1ml不同濃度的細胞懸液相混合。
?、荨』靹蚝罅⒓磧A注于瓊脂基底層上，在室溫中10分鐘，使其凝固，孵育于37℃，5％CO2孵箱中。
?、蕖?～5天后即可見針尖大小白色克隆，7～10天后，直接移種至含飼養(yǎng)細胞的24孔板中進行培養(yǎng)。
?、摺z測抗體，擴大培養(yǎng)，必要時再克隆化。
二 雜交瘤細胞的凍存
及時凍存原始孔的雜交瘤細胞、每次克隆化得到的亞克隆細胞是十分重要的。因為在沒有建立一個穩(wěn)定分泌抗體的細胞系的時候，細胞的培養(yǎng)過程中隨時可能發(fā)生細胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒有原始細胞的凍存，則因為上述的意外而全功盡棄。
雜交瘤細胞的凍存方法同其他細胞系的凍存方法一樣，原則上細胞應在每支安瓿含1×106以上，但對原始孔的雜交瘤細胞可以因培養(yǎng)環(huán)境不同而改變，在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當長滿孔底時，一孔就可以凍一支安瓿。
細胞凍存液:
50％小牛血清
40％不完全培養(yǎng)液
10％ DMSO二甲亞砜
凍存液最好預冷，操作動作輕柔、迅速。凍存時從室溫可立即降到0℃，再降溫時一般按每分鐘降溫2～3℃，待降至-70℃可放入液氮中?；蚣毎芙抵?℃ 后放-70℃超低溫冰箱，次日轉(zhuǎn)入液氮中。也可以用細胞凍存裝置進行凍存。凍存細胞要定期復蘇，檢查細胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性，在液氮中細胞可保存數(shù)年或更長時間。
五、單克隆抗體的大量生產(chǎn)
大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩種：
1. 體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細胞，從上清中獲取單克隆抗體。但此方法產(chǎn)量低，一般培養(yǎng)液含量為10～60μg／ml，如果大量生產(chǎn)，費用較高。
2. 體內(nèi)接種雜交瘤細胞，制備腹水或血清。
?、佟嶓w瘤法 對數(shù)生長期的雜交瘤細胞按1～3×107／ml接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2 ml, 共2～4點。待腫瘤達到一定大小后一般10～20天則可采血，從血清中獲得單克隆抗體含量可達到1-10mg／ml。但采血量有限。
?、凇「顾闹苽洹〕Ｒ?guī)是先腹腔注射0.5mlPristane降植烷或液體石臘于BaLb／c鼠，1～2周后腹腔注射1×106個雜交瘤細胞，接種細胞7～10天后可產(chǎn)生腹水，密切觀察動物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲1～10ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反復收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達5-20mg/ml， 這是目前最常用的方法，還可將腹水中細胞凍存起來，復蘇后轉(zhuǎn)種小鼠腹腔則產(chǎn)生腹水快、量多。
